Mycoplasmen sind die kleinsten sich selbst vermehrenden Prokaryoten aus der Klasse der Mollicutes. Sie besitzen keine feste Zellwand. Aufgrund ihrer Cholesteroleinlagerungen in die Zellmembran sind sie extrem verformbar und können somit die üblichen Sterilfilter (0,2μm) passieren. Mycoplasmen sind parasitär, intra- und extrazellulär lebende Bakterien. Kontaminationen von Zellkulturen mit Mycoplasmen sind häufig und oft nicht leicht zu entdecken, da sie nicht immer dramatische Effekte bewirken. Mycoplasmen können sich rasch auf andere Kulturen ausbreiten (auch über flüssigen Stickstoff). Von allen Infektionen entstehen 95% durch M.orale, M.arginii, M.fermentans, M.salivarum, M.hyorhinis und A.laidlawii. Mycoplasmen sind Parasiten! Sie entziehen den Zellen Nährstoffe, die sie aufgrund ihres kleinen Genoms selbst nicht herstellen können.

Die Auswirkungen einer Mycoplasmen-Kontamination auf die Zellen sind mannigfaltig:

- Mycoplasmen produzieren Toxine, die die Zellen schädigen

- Induktion von Chromosomen-Abberationen

- Änderungen in der Membran-Antigenität

- Erhöhte Zelltod-Rate

- Hemmung der Zellproliferation durch Nährstoffentzug

- Inhibierung des Zellmetabolismus

- Änderungen in der DNA, RNA und Protein-Biosynthese

- Einfluss auf Virenproduktion

- Aktivierung von Immunzellen (Lymphocyten)

Kontaminationen können die Reproduzierbarkeit und Validität von Forschungsergebnissen, sowie die Wirtschaftlichkeit der Produktherstellung erheblich beeinträchtigen. Zellkulturen sollten deshalb routinemäßig auf Mycoplasmen getestet werden. Der Nachweis von Mycoplasmen kann über verschiedene Methoden erfolgen.

Nachweismethoden von Mycoplasmen-Kontaminationen:

Detektionsmethoden:

qPCR (nach Ph. Eur):
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht, aus geringen Mengen heterogener DNA ein spezifisches Fragment millionenfach anzureichern. Die verwendeten Primer umfassen Mycoplasmen-spezifische, hoch konservierte Sequenzen der 16S ribosomalen RNA (rRNA). Die quantitative Echtzeit-PCR oder engl. real-time quantitative PCR (kurz qPCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung von DNA. Sie beruht auf dem Prinzip der „herkömmlichen“ PCR. Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die nach jedem PCR-Zyklus in Echtzeit erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Die PCR kann direkt aus der Probe (z.B. Serum, Medium) oder aus dem Zellkulturüberstand durchgeführt werden. Wird die qPCR nach Ph. Eur. durchgeführt, so wird von einer Probe (200µl) oder aus dem Zellkulturüberstand (200µl) die DNA isoliert und anschließend die qPCR durchgeführt.

Fluoreszenznachweis mit DAPI:
DAPI (4,6’-diamidino-2-phenylindole) ist ein DNA-bindender Fluoreszenzfarbstoff. Er lagert sich bevorzugt an AT-reichen Regionen in der kleinen Furche doppelsträngiger DNA an. Mycoplasmen-Kontaminationen können durch die Anfärbung der Mycoplasmen-DNA mit dem Fluorochrom DAPI festgestellt werden. Die Mycoplasmen erscheinen als gleichmäßig geformte, kleine, hell leuchtende Punkte oder Ansammlungen von solchen außerhalb der Indikatorzellen (meist an der Zellmembran). Da DAPI nicht die RNA und kaum sichtbar die mitochondriale DNA anfärbt, ist die Hintergrundfluoreszenz sehr gering.

Nachweis mycoplasmen-spezifischer Enzyme:
Mit einem biochemischen, hochsensitiven und spezifischen Testkit wird die Aktivität von mycoplasmen-spezifischen Enzymen gemessen. Lebende Mycoplasmen werden lysiert und deren Enzyme freigesetzt. Die freigesetzten Carbamatkinase und Acetatkinase werden mit dem Substrat-Mix inkubiert. Dadurch kommt es zu einer Umwandlung von ADP zu ATP. Das gebildete ATP in der Probe wird über eine Luciferase-Reaktion gemessen. Sind Mycoplasmen in der Probe vorhanden, kommt es zu einer deutlichen Erhöhung des ATP-Levels, was zu einer verstärkten Lichtreaktion führt.

Produktempfehlung
Aus wissenschaftlicher und ökonomischer Sicht ist eine nachhaltige Entfernung von Mycoplasmen aus der Zellkultur unbedingt erforderlich. Nicht immer können infizierte Zellkulturen verworfen und durch neue ersetzt werden. Auch können infizierte Zellen nicht mit den Standardantibiotika behandelt werden. Da die Effizienz dieser Antibiotika-Behandlung meist ungenügend ist. Mycorase 50x Solution (PAN-Biotech, Produktnummer P06-02100) ist ein Reagenz zur dauerhaften Eliminierung von Mycoplasmen in der Zellkultur.

Folgende Viren-Testungen werden nach der EMEA Richtlinie CPMP/BWP/1793/02 (Note for Guidance on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal products) durchgeführt:

- Bluetongue und verwandte Orbiviren

- Bovine Adenovirus

- Bovine Parvovirus

- Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV)

- Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV)

- Rabies Virus (Tollwut)

- Reovirus 3

- Bovine Polyoma Virus (BPyV)